Skrining bakteriologia
Przedmiotem przedsięwzięcia EU-OPENSCREEN ERIC w zakresie skriningu bakteriologicznego jest przygotowanie infrastruktury i procedur umożliwiających realizację projektów mających na celu poszukiwanie nowych substancji przeciwbakteryjnych. Zautomatyzowana platforma, działająca w standardzie bezpieczeństwa biologicznego BSL-1 i 2 umożliwia testowanie różnorodnych związków aktywnych biologicznie pod kątem wpływu na metabolizm bakterii Gramm-dodatnich oraz Gramm-ujemnych. Ponadto, platforma skriningowa, wykorzystując skonstruowany w laboratorium szczep prątka Mycobacterium bovis z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP), może znaleźć zastosowanie w poszukiwaniu nowych substancji o działaniu przeciwprątkowym. Dzięki posiadanemu doświadczeniu oraz posiadanemu laboratorium o klasie bezpieczeństwa BSL-3 jednostka może również realizować projekty w zakresie identyfikacji mechanizmu działania nowych związków przeciwgruźliczych. Wykorzystując szczepy laboratoryjne lub kliniczne prątka Mycobacterium tuberculosis skuteczność potencjalnych inhibitorów może być walidowana różnorodnymi metodami molekularnymi jak: analiza tempa mutacji, selekcja i masowe sekwencjonowanie mutantów opornych, konstrukcja mutantów ukierunkowanych w celu identyfikacji potencjalnych miejsc docelowych dla substancji badanych oraz implementacja testów biochemicznych badających aktywność związków na określone białko prątka do skriningu automatycznego.
FILM 1 link
LiHa (Liquide handling arm) stacji pipetującej Freedom Evo (Tecan) przy pracy. Pipetowanie podłoża wzrostowego na płytkę 96 do testu skriningowego.
FILM2 link
RoMa (Robotic manipulator arm) stacji pipetującej Freedom Evo (Tecan). Transfer płytki między stanowiskiem pipetowania a inkubatorem.
Procedury skriningowe
Skrining związków przeciwbakteryjnych oparty jest o kolorymetryczny test pozwalający na ocenę żywotności wzorcowych szczepów bakterii Gramm-ujemnych i Gramm-dodatnich w formacie 96 studzienkowej płytki titracyjnej. Test oparty jest o kolorymetryczny pomiar aktywności oddechowej komórek bakterii i wynikającej z niej zdolności do redukcji niebieskiej rezazuryny do różowej rezorufiny.
Literatura:
1. Weinstein MP et al., Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests of Bacteria That Grow Aerobiocally. 2018. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), M07, 11th ed.
2. Korycka-Machała M, Viljoen A, Pawełczyk J, Borówka P, Dziadek B, Gobis K, Brzostek A, Kawka M, Blaise M, Strapagiel D, Kremer L, Dziadek J. 1H-Benzo[d]Imidazole Derivatives Affect MmpL3 in Mycobacterium tuberculosis. 2019. Antimicrob Agents Chemother. Sep 23; 63(10):e00441-19
Laboratorium zajmuje się opracowywaniem testów biochemicznych badających aktywność różnorodnych związków chemicznych na określone białka prątka gruźlicy oraz ich implementacją do skriningu automatycznego:
- Sposób typowania inhibitorów NAD+ – zależnej ligazy DNA. Patent – Nr P.401634, 2015.
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu typowania inhibitorów NAD+-zależnej ligazy DNA. W metodzie wykorzystano znakowaną sondę DNA o wielkości 40 par zasad z pojedynczym pęknięciem na jednej nici. Nowością jest sama analiza produktów ligacji przy wykorzystaniu sekwenatora. Aparat pozwala na szybką, jednorazową analizę kilkudziesięciu (płytka titracyjna 96-studzienkowa) próbek badanych związków. - Badanie aktywności fosfatazy enzymu poly(A) adenylazy PAP1 w systemie kolorymetrycznym. Uzyskane w systemie ekspresyjnym E.coli rekombinowane, mykobakteryjne białko PAPI posiada aktywność nukleotydylotransferazy, poliadenylazy oraz fosfatazy. Zahamowanie aktywności fosfatazy wpływa również na pozostałe aktywności niezbędne w komórkach prątków gruźlicy. Hamowanie aktywności fosfatazy białka PAPI prowadzone jest z wykorzystaniem substratu p-nitrophenyl phosphate (PNPP), którego hydroliza prowadzi do uzyskania chromogennego produktu o absorbancji w długości fali 405 nm.
- Badanie aktywności PNP-azy. PNP-aza zaangażowana jest w degradację mRNA wraz z białkami RNA degradosomu. Posiada dodatkowo funkcję syntetazy pentafosforanu guanozyny. Opracowany dla białka PNP-azy test kolorymetryczny z wykorzystaniem zieleni malachitowej pozwala selektywnie oceniać hydrolizę ppGpp.
Laboratorium posiada doświadczenie w walidacji różnorodnych białek prątka M. tuberculosis jako niezbędnych dla przeżycia komórki patogenu in vitro bądź niezbędnych w patogenezie gruźlicy przy zastosowaniu technik ukierunkowanej mutagenezy. Laboratorium posiada dużą kolekcję mutantów ukierunkowanych Mycobacterium dostępnych do różnorodnych analiz:
http://ibmpan.pl/images/pracownie/pgifm/tabela_DCO_PGiFM.htm
Ukierunkowana inaktywacja bądź nadekspresja wybranych genów prątka gruźlicy połączona z analizą fenotypu w różnych warunkach wzrostu może być także wykorzystana w naszym laboratorium jako narzędzie do identyfikacji mechanizmu działania różnorodnych substancji o potwierdzonej aktywności przeciwprątkowej.
Literatura:
- Kuron A, Korycka-Machala M, Brzostek A, Nowosielski M, Doherty A, Dziadek B, Dziadek J.
Evaluation of DNA primase DnaG as a potential target for antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58(3):1699-706. - Korycka-Machała M, Viljoen A, Pawełczyk J, Borówka P, Dziadek B, Gobis K, Brzostek A, Kawka M, Blaise M, Strapagiel D, Kremer L, Dziadek J.
1H-Benzo[d]Imidazole Derivatives Affect MmpL3 in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2019 Sep 23; 63(10):e00441-19. doi: 10.1128/AAC.00441-19. - Pawelczyk J, Viljoen A, Kremer L, Dziadek J. The influence of AccD5 on AccD6 carboxyltransferase essentiality in pathogenic and non-pathogenic Mycobacterium. Sci Rep. 2017 Feb 16;7:42692. doi: 10.1038/srep42692
- Pawelczyk J, Brzostek A, Kremer L, Dziadek B, Rumijowska-Galewicz A, Fiolka M, Dziadek J. AccD6, a key carboxyltransferase essential for mycolic acid synthesis in Mycobacterium tuberculosis, is dispensable in a nonpathogenic strain. 2011. J Bacteriol 193, 6960–72